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硼中子俘获治疗最有效的硼传递剂
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像人类Y1受体这样的G蛋白偶联受体在癌症治疗中是有希望的目标，因为它们在癌细胞上的高度过表达以及与结合的配体一起内在化的能力。利用这种机制将硼原子穿梭到癌细胞中，以应用硼中子捕获疗法，这是一种消除癌细胞的非侵入性方法。每个肽分子最多载有80个硼原子的支化共轭物表现出维持的受体活化特性，并选择性摄取到hY1通过内在化研究证明了表达R的细胞。为了确保在水溶液中的适当溶解度，我们证明每个碳硼烷需要八个羟基。因此，我们建议在固相肽合成中利用双脱氧半乳糖基碳氢化合物构件来生产用于BNCT的选择性硼传递剂。
通过向肿瘤细胞靶向递送抗癌药物，可以通过保留肿瘤周围的健康组织来增强所需癌症治疗的疗效并避免严重的副作用。将治疗活性分子缀合至肿瘤选择性载体系统有助于该方法。近来，肽配体由于其容易合成，低免疫原性和高靶标亲和力和选择性而作为载体分子引起了广泛关注。生长抑素，蛙皮素和促性腺激素释放激素的放射标记或毒素结合的类似物用于靶向它们各自在肿瘤细胞上的受体。神经肽Y，三元NPY激素家族的36个氨基酸的肽，最近也引起了人们的极大兴趣。NPY家族以纳摩尔亲和力与人类的4种G蛋白偶联受体亚型结合，即人Y1，Y2，Y4和Y5受体。NPY配体的特异性结合导致活化，然后通过受体介导的内吞作用将肽-受体复合物内化到细胞中。BNCT的原理是硼在癌细胞中的积累，然后用热中子对肿瘤部位进行局部照射。具有非常高的中子俘获截面的同位素俘获中子，导致裂变反应，产生α粒子和锂原子核具有很高的线性能量转移。这些LET粒子的光程长度为5–10μm，与细胞直径一致，因此将其破坏作用限制于含硼细胞。为了成功进行BNCT，癌细胞中必须积累大量的硼，才能从硼中子捕获反应中适当产生辐射。所需的硼原子与局部中子辐照结合的选择性肿瘤递送可以实现BNCT有望的双重选择性治疗效果。然而，仍然缺少合适的具有高的肿瘤与正常细胞分布比的硼输送剂。两种化合物均表现出次佳的BNCT功效，主要是由于它们的低肿瘤选择性。因此，硼修饰的NPY类似物作为BNCT的乳腺癌靶向硼递送剂成为有前途的载体。使用脱氧半乳糖吡喃糖基修饰的碳硼烷结构单元可确保在水溶液中具有适当的溶解度，从而每个肽分子最多可掺入80个硼原子，从而提高了硼向癌细胞的选择性递送。
碳硼烷的合成
在这项研究中，所有的碳硼烷结构单元均含有一个羧基，以便直接与固相支持物上的肽偶联，并且使用了该簇的间位异构体形式，以实现在水溶液中的适当化学稳定性。它包含用于肽偶联的巯基乙酸连接基，该连接基与碳硼烷簇的硼原子连接。由于碳硼烷是高度疏水的分子，因此选择单糖单元以增加结构单元的亲水性。因此，在间位甲基的碳原子上引入一个或两个α-D-脱氧半乳糖吡喃糖基部分。由于两个碳原子在化学上均具有同等反应性，因此一个α-D-脱氧半乳糖基部分的引入导致形成1--9--1,7-二dicarba-闭合碳-dodecaborane和1--10--1,7-二氮杂dicarba-闭合碳-十二硼烷。为了在肽合成中用作构建单元，将脱氧半乳糖基部分的羟基保护为1,2-丙酮化物，在最终从固体支持物上裂解时将其除去。
双脱氧半乳糖基碳氢化合物可提高缀合物的稳定性，而不会显示细胞毒性
除了摄取研究之外，还分析了肽缀合物20的固有细胞毒性。MCF-7细胞与20在培养基中孵育48小时，随后通过基于刃天青的毒性测定法确定细胞活力。直至浓度为10μM，对于对照肽11和缀合物20均未观察到细胞活力的降低。这表明用构件块8对无毒肽11的8倍修饰是良好耐受的，并且不会导致任何固有的细胞毒性。此外，高碳硼烷负载的共轭物22还研究了其在血浆中的稳定性。将TAMRA修饰的对照肽21用作基准。两种缀合物均显示原始肽随时间减少。而对照肽21表现出3.6h只需的半衰期，所述缀合物22显示出大于100小时的半衰期。
BNCT是一种有前途的下一代癌症治疗方法，这是近来在医院兼容的用于中子束产生的线性加速器开发方面取得的最新进展的结果。新型硼释放剂具有更高的选择性和最大的硼负荷，其开发提高了BNCT的治疗效率，从而为常规临床应用奠定了基础。通过使用受体靶向的肽类似物作为硼化合物的载体系统，实现了更高的硼递送选择性。除了在不同类型的癌症中高表达外，hY的内在化1R与结合的配体一起促进了硼化合物在细胞内的定位，导致向BNCT中癌细胞的DNA传递更高的辐射剂量。以前已经提出过使用内在化，靶向受体的肽配体作为BNCT药物的概念。尽管具有肿瘤选择性，另一方面必须考虑成功实现BNCT的另一个方面是将非常大量的硼输送到癌细胞中。计算机模拟确定每个单元大约需要10的次方个硼原子，才能从中子俘获裂变反应中获得足够数量的破坏性LET粒子。因此，使每个分子具有最大数量的硼原子的输送化合物负载对于产生具有最佳硼穿梭效率的系统至关重要。它们包含高硼含量，每个分子含10个硼原子，并且具有适当的生物稳定性。此外，碳硼烷簇的顶点可以很容易地化学官能化，这允许通过肽化学并进一步调节构件的物理化学性质掺入肽中。作为开发富含硼的NPY共轭物的第一步，我们评估了间位甲硼烷2对肽的修饰。最近，我们已经将碳硼烷2描述为用于修饰肽生长素释放肽受体激动剂的合适构件。
总体而言，获得的结果证明了缀合物20的高潜力作为BNCT的硼输送剂。以前仅在一些研究中描述了将高硼负载的生物分子载体系统用于BNCT。据报道重硼化的聚酰胺酰胺树状大分子与EGF或西妥昔单抗和西妥昔单抗的单克隆抗体L8A4缀合，以靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR或其突变体亚型EGFRvIII。通过这种方法，获得了载有约1000个硼原子的大分子载体，并且在携带EGFR/EGFRvIII转染的F98胶质瘤的大鼠中获得了第一个阳性BNCT结果。然而，这些巨大的生物缀合物的制备相当费力，此外，人脑胶质瘤中靶EGFR和EGFRvIII的高表达异质性阻碍了进一步的临床开发。较小的生物分子细胞穿透肽）被8个BSH分子修饰成树枝状结构，还用作载体系统。所得的富含硼的CPP偶联物在小鼠中的神经胶质瘤细胞中积累，而正常大脑没有摄取，并且在体外中子照射神经胶质瘤细胞后具有明显的BNCT效应。然而，尽管已报道了选择性的肿瘤递送，但对阳离子CPPs摄取细胞的特异性仍存在争议。因此，我们提出了使用与碳水化合物修饰的碳硼烷簇偶联的肿瘤靶向肽来抵消疏水性的概念。与BSH和BPA相比，建议高选择性和无毒的肽偶联物可导致高的肿瘤选择性，并具有使用减少剂量的这些新型硼化合物的潜在潜力。
血浆稳定性测定
荧光标记的肽在人血浆中在37摄氏度恒定摇动下的浓度孵育。在孵育开始时和其他时间点取样，并在-20摄氏度下用100μLACN沉淀至少1小时。在第一个离心步骤以14000rpm离心30s后，将上清液用100μLH2稀释O，并使用CostarSpin-X离心管过滤器再次以12000rpm离心1h。肽溶液的荧光发射是通过RP-HPLC在AgilentVariTideRPC上使用洗脱液B在A中的洗脱液B的线性梯度在λ=573nm处检测色谱柱将峰面积归一化为起始峰，并通过使用GraphPadPrism5进行单相衰减分析来计算半衰期。数据点代表至少两个独立实验的平均值±SEM。
肌醇磷酸积累测定
如前所述，进行了肌醇磷酸酯积累测定法来确定受体的活化。简要地，将稳定地与hY1R或hY2R和嵌合G蛋白共转染的COS-7细胞接种到48孔板中，培养过夜。细胞用肌醇肌醇不经青霉素和链霉素过夜，并用在DMEM不同肽浓度刺激补充有10mMLiCl和0.1％BSA的培养基在37摄氏度下放置1小时。通常在10–5M至10–11的浓度范围内测试化合物M一式两份。通过阴离子交换色谱分离放射性IP种类，并通过闪烁计数进行测量。数据分析使用GraphPadPrism5.03进行。将获得的原始dpm值归一化为NPY，并从S型浓度-响应曲线计算EC50和pEC50值。每个肽至少要独立测试两次。
肌醇单磷酸累积测定
如先前所述进行磷酸肌醇-一种测定。简而言之，将与hY1R-eYFP或hY2R-eYFP和嵌合G蛋白稳定共转染的COS-7细胞接种在白色的384孔板中，并在37摄氏度和5％CO2的湿润气氛下生长24小时。在第二天，将板倒置翻转以除去培养基，并在37摄氏度和5％二氧化碳下，用浓度增加的HBSS中添加了20mMLiCl的HBSS刺激细胞，刺激细胞1小时。在10–5M至10–13的浓度范围内测试肽M一式三份。随后根据制造商的说明，使用CisbioIP-OneGqHTRF分析试剂盒对生成的肌醇单磷酸酯进行定量。对于测定读出，使用TecanSpark微孔板读取器。数据分析使用GraphPadPrism5.03进行。将获得的化合物的HTRF值归一化为NPY，并从S型浓度-响应曲线计算EC50和pEC50值。每个肽至少要独立测试两次。
内部化研究
将CY端融合至eYFP稳定转染的HEK293细胞以一定密度接种到ibiTreat8孔μ玻片上每孔300,000个细胞培养24h，直至细胞达到融合。相应地以120000个细胞/孔的密度接种MCF-7细胞。吸出培养基，将细胞置于200μLOpti-MEM和1μL核染色剂Hoechst33342中饥饿。在标准孵育条件下放置30分钟。对于未刺激的细胞，将溶液吸出并添加200μLOpti-MEM。为了测试NPY类似物的受体内在化，吸出饥饿的培养基并加入200μL的Opti-MEM，其中包含100nM肽或1μM肽添加到细胞中。在37摄氏度刺激1小时后，将细胞洗涤一次并保存在Opti-MEM中。使用带有ApoTome.2成像系统和63x浸油物镜的ZeissAxio观察者显微镜进行荧光图像采集。通过DAPI滤光片和通过YFP滤光片感受器上的eYFP标签可以看到Hoechst33342核染色。图像处理使用ZeissZEN2软件进行。
细胞毒性测定
通过刃天青测定法评估细胞毒性。将MCF-7细胞接种在96孔板中并培养过夜。在HBSS中制备肽稀释液，一式两份加到细胞中，使其最终浓度达到0.1μM，1μM或10μM。作为阴性对照，仅在HBSS中用0.5％DMSO处理细胞。在37摄氏度下孵育48小时后，吸出刺激培养基，并将细胞与HBSS中的10％刃天青溶液在37摄氏度下孵育1小时。作为阳性对照，在刃天青孵育之前，将细胞在水中用70％乙醇处理10分钟。使用TecanInfiniteM200读板仪检测活细胞中形成的试卤灵的荧光。仅对中等处理的细胞和用70％乙醇处理的细胞将测量值标准化。实验独立进行了三次。 |
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