研究机构报告了通过UV-C曝光在聚碳酸酯核径迹探测器上形成生物材料的烙印，这是一种同时可视化来自硼中子捕获反应的细胞烙印和核迹线的方法。考虑到细胞核比细胞质具有更高的UV-C吸收率，并且苏木精优先对细胞核染色，硼中子俘获治疗研究机构建议在UV-C致敏之前通过苏木精染色来增强这两个主要细胞结构之间的对比度。在这项研究中，进行了一些实验，以优化使用SK-BR-3乳腺癌细胞系的UV-C曝光参数和化学刻蚀条件，以形成细胞印迹。所提出的方法显着提高了细胞印迹的分辨率。它可以使细胞核与其他细胞清楚地区分开，并带有核径迹坑。而且，它大大减少了UV-C暴露时间，这是一个重要的实验问题。所提出的方法可以独立于所选的细胞系和/或硼化合物而用于研究硼的分布。
硼中子俘获治疗是一种联合放射疗法，可用于局部控制实体瘤。其基于施用选择性地积聚在肿瘤细胞中的富含10B的化合物，以及随后对待治疗区域进行中子辐照。以这种方式，发生了中子俘获反应10B7Li，这对于热中子极有可能发生，以发射α粒子和反冲的7Li离子。这些带电粒子的发射具有高线性能量传递，并且在组织中具有近距离分布，与细胞大小相当。BNCT的有效性取决于有选择地积累10考虑到最相关的剂量成分是由于捕获反应后的崩解，癌细胞中的B原子。与其他放射疗法相比，这代表了放射生物学的优势。因此，BNCT将使健康组织中浸润性肿瘤细胞的选择性损伤成为可能，这是当前放射疗法的挑战。
在这种情况下，了解10B原子在组织甚至细胞水平上的定位对于评估治疗的成功可能性和了解照射后观察到的放射生物学效应至关重要。该信息可以通过使用核径迹检测器的中子放射自显影技术提供。它是一种强大的方法，可将给定样品中的10B空间微观分布与检测器上记录的损伤相关。NTD的使用基于它们永久保存由于粒子撞击其表面而产生的结构变化的能力。这些潜在的损害可以通过化学蚀刻工艺来放大。化学试剂在接近粒子轨迹的区域比散装材料以更高的速率起作用。这一事实产生了构成核径迹的“通道”，在光学或电子显微镜下可见。
对于与BNCT有关的样品，BNC反应的产物会在NTD表面上形成轨迹。为此，检测器-生物样品组必须以特定的通量进行热中子辐照。之后，必须去除生物样品以进行化学蚀刻。放射自显影图像由核径迹形成，并且可以记录在图像分析系统中。为了使核径迹的微分布与感兴趣的生物结构在空间上相关，必须事先使用图像共配准技术对生物样品进行拍照。
研究机构已广泛探索了使用聚碳酸酯作为NTD在组织水平进行中子放射自显影的不同方法。定性中子放射自显影和定量中子放射自显影已被应用到不同的生物模型BNCT研究。基于研究人员在聚碳酸烯丙二酯碳酸酯上的工作，硼中子俘获治疗研究机构的研究小组还报告了通过以下方法在聚碳酸酯上获得蜂窝状轮廓的可行性。UV-C曝光，采用与扩大核径迹相同的蚀刻程序。为了建立在聚碳酸酯基底上的细胞培养条件，进行了不同的实验。此外，设置了最佳条件以同时可视化来自BNC反应的细胞印迹和核径迹。另一方面，硼中子俘获治疗研究机构小组报告了通过UV-C辐射降低了敏化聚碳酸酯箔的核径迹密度。对于来自BNC反应的离子，轨道密度与暴露于UV-C的时间之间的关系逐渐减小，并且发现增加UV-C的暴露时间会使Vb增大至饱和。。
在这项工作中，硼中子俘获治疗研究机构提出了结合聚碳酸酯NTD的UV-C敏化的中子放射自显影技术的改进。目的是提高核径迹与主要细胞结构或区室之间的空间分辨率。该研究的重点是缩短UV-C照射时间。可以减少因UV-C暴露而产生的径迹密度损失，从而增强细胞印迹的对比度，同时在单个图像中保留核径迹。这样，可以避免使用图像共配准方法。
为了建立细胞附着到聚碳酸酯检测器的实验条件，进行了初步研究。在接种细胞前3小时，将厚度为250µm且直径与24孔板兼容的圆形聚碳酸酯检测器箔片在70％ETOH中灭菌。为了改善细胞附着，解决了不同的策略。将Lexan箔嵌入磷酸盐缓冲液，培养基或FBS中24小时。这些箔用PBS洗涤，并沉积在未经组织培养的p-24孔上，用于随后的细胞接种。24小时后，除去培养基，将细胞用PBS洗涤3次，并用TEM质量的戊二醛在2%PBS中的溶液在低温下固定10分钟。最后，除去固定溶液，并使具有固定孔的箔干燥。作为细胞生长的控制，
考虑到细胞核比细胞质具有更高的UV吸收率，并且苏木精优先对细胞核染色，硼中子俘获治疗研究机构建议在进行UV-C敏化之前通过苏木精染色来增强这两个主要细胞结构之间的对比度。硼中子俘获治疗研究机构研究了使用SK-BR-3细胞系和苏木精染色5和15分钟的印迹形成。还评估了没有苏木精的对照组。
为了在Lexan箔片中生成α和7Li轨道以同时显示细胞印迹，在确定的条件下接种细胞。24小时后，将它们与添加到相应培养基中的10B富集的硼酰苯丙氨酸和果糖一起孵育，最终浓度为30ppm10B，在48分钟内H。选择孵育时间以确保掺入足够的硼以建立这项工作中提出的技术。然后，除去培养基。用PBS洗涤细胞3次，并用前述方法固定。以1012或1013cm-2照射样品RA-3反应堆中的中子通量。一旦进行了中子辐照，就进行了细胞印迹中描述的相同步骤。
根据下面中的关系，通过测量不同厚度下的去除材料厚度，确定聚碳酸酯箔UV-C暴露2和5分钟的整体蚀刻速率Vb。
在蚀刻过程之前,用环氧树脂部分覆盖聚碳酸酯箔的表面,从而在聚碳酸酯箔上形成台阶。H的测量是通过微纳技术部的表面轮廓仪进行的。将H的测量值与硼中子俘获治疗研究机构小组报告的未曝光箔和“30minUV-C”条件下的测量值进行比较。
为了表征在具有细胞印迹的放射自显影图像中对核径迹的衰落效应，进行了定性和定量的径迹密度分析。第一步，在没有细胞印迹的核径图像上评估褪色效果。为此，选择了具有均匀硼分布的参考样品。随后，对具有细胞印迹的放射自显影图像进行了研究。由于与硼掺入有关的生物学变异性，这种条件在核径迹分布中具有固有的异质性，必须进行进一步分析。
将与聚碳酸酯箔接触的硅标准NIST2137中的10B植入物暴露于中子注量下。这种能量密度足够低，可以避免核迹线重叠，从而可能危害单个计数。中子辐照后，将箔片暴露于UV-C辐射5分钟或30分钟，然后进行化学蚀刻。作为参考，将这些箔与无UV-C暴露条件进行了比较。最后，获得了核径迹的显微照片，并按《成像与分析》中的详细说明进行了分析。
用光学显微镜与CCD相机耦合获得显微照片。设置光照条件以获得最佳质量和可再现的图像。
为了量化放射自显影图像的径迹密度，必须识别并计数核径迹。使用软件ImageProPremier™进行了图像分析过程9.2。首先将基于阈值的图像分割应用于每个灰度图像。然后，基于手动选择的参考对象的学习分类方法被应用，以区分核径迹坑与在分割过程中获得的其他对象。先前已经研究了与区分核径迹有关的多个参数，包括面积，圆形度和纵横比，用于训练算法。进行了培训，以测量用户手动选择的几个对象中的这些参数。通过将结果与手动计数进行比较来验证此过程。
为了保证细胞在聚碳酸酯上的附着力，硼中子俘获治疗研究机构首先测试了不同的预处理条件。选择PBS条件进行预处理，因为与对照样品相比,它对细胞附着和生长或形态的影响可忽略不计。其他策略导致明显的细胞死亡或异质生长。该固定方案实现了良好的细胞结构维护和质量。
建立细胞附着和固定方案后，使用苏木精染色进行细胞印迹形成实验。观察到使用苏木精染色改变蚀刻和UV-C曝光时间的效果。第一列显示在暴露于UV-C之前用苏木精染色5分钟的细胞培养物。其他两列显示在不同蚀刻时间分别为2分钟和4分钟的第一列中描绘的同一区域的细胞印迹。连同蚀刻时间变化，与UV-C曝光时间相对应的图片显示在不同的行中：15、30、60和120分钟。
在UV-C照射之前使用苏木精可以使细胞核与其他细胞区分开来。印记会在原始染色的细胞图像中复制发现。将蚀刻时间从2分钟增加到4分钟会导致对比度增强，并在Lexan箔片上记录“更清洁”的图像。众所周知，较长的蚀刻时间会产生较大的核径迹，从而使核径迹与细胞痕迹更好地区分开。关于UV-C照射，随着曝光时间增加，特别是30分钟或更长时间，可以观察到更加恶化的细胞印迹。这可能会损害突出细胞结构的能力。此外，减少曝光时间对于轨道可视化至关重要。
考虑到先前的结果，然后通过将染色时间增加到15分钟来研究2、5和15分钟的照射时间。作为对照样品，将一组Lexan箔片暴露于UV-C辐射，而无需苏木精染色。正如硼中子俘获治疗研究机构先前的工作所确定的那样，细胞结构以不同的水平吸收UV-C辐射，从而在蚀刻的检测器表面产生浮雕。第一列中值得注意的是，细胞印迹是由每个细胞结构的UV-C吸收形成的。此外，通过将染色时间设置为15分钟，可以注意到印记中的细胞结构在所有曝光时间内均具有更大的对比度。对于建议的分析，在5分钟和15分钟内获得的结果在细胞室鉴定方面没有显着差异。期望通过减少曝光时间来减少轨道褪色，硼中子俘获治疗研究机构放弃了15分钟的UV-C。另一方面，尽管在2分钟的曝光下产生的细胞印迹可以接受，但在5分钟的曝光时间下，细胞印迹的图像对比度似乎对于清晰识别结构而言是最佳的。
一旦建立了产生细胞印迹的参数，就可以进行评估同时显示核径迹和细胞结构的实验。苏木精染色以及SK-BR-3细胞培养物中相同区域的相应细胞印记和核径迹图像可以被欣赏。必须强调的是，苏木精染色图像仅用于强调细胞印迹图像与原始样品之间的对应关系。在进一步分析中，将不需要该图像。可以观察到，只要在显微镜焦点上稍作改变，就可以实现轨迹或细胞印迹的可视化。这与以下事实有关：两种损坏都发生在NTD材料结构的不同深度处。
与仅由核径迹形成放射自显影图像的NIST标准进行的衰落分析相比，细胞印迹的研究更为复杂。在这些图像中，必须区分被归类为来自BNC反应的跟踪坑的对象和与细胞印迹结构相关的对象。
对象分类学习算法如何处理具有BNC反应发生在细胞中的核径迹的样品。存在10在细胞内的B原子可以通过在核轨道在两个图像中不具有和具有细胞压印。可以理解，蓝色物体被分类为“核迹”，而绿色物体被分类为“其他物”。这些最后的那些不用于轨道密度测量。
相对于没有UV-C暴露5分钟的UV-C的磁道密度值。无论使用苏木精染色，都可以观察到轨迹密度的损失。此外，在无苏木精染色条件下，这种损失更大。应当注意，在这些样品的磁道密度测量中发现的分散度与测量方法无关，而与与细胞接种和硼吸收相关的生物学变异性有关。同样，定性地比较了30分钟的UV-C曝光时间与5分钟的UV-C曝光时间，光道密度的损失显着，核径迹更小，对比度更差。无需进一步的定量分析即可证明在30分钟内观察到的显着褪色效果。
在国家原子能委员会的阿根廷硼中子俘获治疗项目的框架内，一项研究项目旨在研究将BNCT应用于治疗HER-2乳腺癌亚型局部复发的可行性。发展。该策略考虑了免疫脂质体作为硼载体纳米载体的设计和使用，以靶向HER-2过表达的细胞，这是一个范例案例研究。在这种情况下，中子放射自显影与UV-C敏化相结合将使对硼纳米载体传输性能的研究最优化。
为了建立用于该应用的实验条件，在当前研究中选择了SK-BR-3和MCF-7乳腺癌细胞系。成功为SK-BR-3乳腺癌细胞系建立了在聚碳酸酯检测器上的细胞接种和生长条件。当与其他细胞系一起工作时，所描述的协议可能会有所不同。实际上，在先前用黑素瘤细胞系进行的工作中，必须在培养基上预处理24小时才能在Lexan上获得足够的细胞分布。
既定的方案也应用于MCF-7乳腺癌细胞系，以测试硼中子俘获治疗研究机构在另一种感兴趣的细胞系上的建立。不仅获得了高质量的细胞生长，而且获得了清晰定义的印迹和核径迹。考虑到该技术在硼化合物性能评估中的潜在应用，这是一个相关的问题。但是，更换细胞系时应修改协议。
可以观察到，由于各种细胞结构对UV-C吸收的差异，细胞印迹形成与聚碳酸酯检测器上的不均匀损伤有关，细胞核的吸收高于细胞质。苏木精的使用由于细胞核的优先染色而突出了这种作用，因此可作为UV-C“保护剂”。然后，当先前使用苏木精时，仅5分钟的UV-C曝光就足以获得高质量的压印图像。与先前研究中应用的6hUV-C暴露相比，这一事实表明辐照时间大大减少。
此外图像中可以看到苏木精的“保护”作用。将固定在聚碳酸酯检测器上的SK-BR-3细胞用苏木精染色5分钟，然后暴露于UV-C2或6h。最后，将检测器蚀刻2分钟。在UV-C暴露2小时后，可以区分细胞核和细胞质。尽管细胞质轮廓定义不清，但有可能使细胞彼此区分。甚至可以观察到核内对比度较高的区域，因为它们对苏木精的吸收更大。另一方面，在紫外线-C照射6小时后，观察到苏木精染色较少的细胞结构消失了，而染色染色较大的结构则保持了清晰的轮廓。
关于细胞印记与核径迹的可视化，除2分钟的UV-C暴露时间外，在所有研究条件下均获得了对比度良好的图像。此外，对于5分钟到30分钟的UV-C照射时间，可以观察到最佳质量的图像。在该范围内，印记没有明显的差异。对于大于30分钟的曝光时间，观察到轮廓变差并因此失去了对比度。
考虑到发现对核径迹的褪色效应与UV-C照射时间有关，因此选择了最短的暴露时间以在不影响细胞印迹质量的情况下减少这种影响。实际上，观察到在30分钟的UV-C照射下轨道密度降低和轨道质量下降。这是一个重要的问题，在尝试对UV-C敏化后的未知样品的径迹密度进行定量时，必须考虑到这一点。
从NIST标准分析中可以看出，减少UV-C暴露时间对核径迹密度有直接影响。但是，当没有生物材料保护检测器时，UV-C暴露5分钟会损失几乎一半的核径迹。当生物基质与检测器接触时，可以观察到相对磁道密度略有增加。此外，苏木精的保护作用也会影响轨道密度。当在照射前进行染色时，保留了约75％的核径迹。但是，由于生物学上的可变性，该值不能视为恒定值。显示了在染色条件和5分钟的UV-C暴露下的迹线密度测量。在分析的不确定性范围内，不同样品中存在类似的磁道密度损失。
在这项工作中，硼中子俘获治疗研究机构建立了实现高对比度细胞印迹和核迹线的参数。区分细胞区室的能力对研究微量剂量法非常重要，因为应该知道细胞中核径迹的分布。在那种情况下，将需要单独的核径迹计数，以便在细胞室之间进行精确的径迹密度确定。进一步的分析可以得出更精确的结果。这项研究超出了这项工作的范围，但是可以通过已建立的技术来实现。
通过这项工作中提出的不同实验，建立了一种协议，无需使用共配准成像技术即可获得细胞印迹的高分辨率放射自显影图像以及来自BNC反应的核径迹。此外，应用此方法不需要特殊的设备或成像采集设备。
作为补充，硼中子俘获治疗研究机构能够显着减少UV-C的曝光时间，从而降低褪色效果。硼中子俘获治疗研究机构还在来自生物样品的放射自显影图像中首次表征了这种效果。
该方法是一种可用于不同细胞系的工具，可根据它们的微分布研究和比较不同的硼化合物。此外，在需要空间微分布的BNCT微剂量计算中，该技术可能会产生关键影响。
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