硼中子俘获治疗用于治疗前列腺癌

　　硼中子俘获治疗是一种治疗手段，已用于治疗癌症，包括脑和头颈部肿瘤。为了通过BNCT进行有效治疗，需要将高剂量的硼有效且选择性地递送至癌细胞。前列腺特异性膜抗原是前列腺癌成像和药物递送的目标。在这项研究中，我们将硼酸或碳硼烷官能团缀合到一个完善的PSMA抑制剂支架上，以将硼递送至前列腺癌细胞和前列腺肿瘤异种移植模型。合成了八种含硼的PSMA抑制剂。所有这些化合物在竞争性放射性配体结合测定中均表现出对PSMA的强结合亲和力。三种选择的化合物1a，将1d和1f给予小鼠，并通过正电子发射断层扫描成像和生物分布实验证明了它们对Ga-PSMA-11摄取的体内阻断作用。生物分布分析表明，与最常用的BNCT化合物4-borono-1-苯丙氨酸的比率相比，在22Rv1前列腺异种移植肿瘤中硼的摄取为4–7μg每克，并且肿瘤/肌肉的比率相似。综上所述，这些数据表明，经过适当优化后，PSMA靶向BNCT药物在前列腺癌治疗中具有潜在作用。
　　 硼中子俘获治疗是一种癌症治疗方法，其基础是将含硼药物选择性摄取到癌细胞中，而不是正常细胞，然后选择性中子束暴露于癌性区域。该辐照引发细胞毒性α颗粒和锂离子的发射。释放的高线性能量转移α粒子只能在组织中传播大约9μm的距离，大约是细胞的直径。因此，它们的短程细胞毒性可以显着改善肿瘤控制，同时保留周围的正常组织。这种治疗方法已成功用于患有原发性脑和头颈部肿瘤的患者的治疗。临床上使用的BNCT试剂包括4-硼烷-1-苯丙氨酸和硼氢化钠。然而，由于各种限制，包括相对较低的靶标与背景比例的硼标记治疗剂结合，BNCT尚未成为大多数癌症类型的护理治疗方式的标准。
　　 前列腺癌是男性中最普遍的非皮肤癌之一。前列腺特异性膜抗原，也称为谷氨酸羧肽酶II或N-乙酰基-1-天冬氨酰-1-谷氨酸肽酶，是在前列腺癌细胞上高表达的细胞表面酶。最近，针对PSMA酶促结构域的基于脲的抑制剂已被开发用于前列腺癌的成像和治疗。使用177Lu和225证明了放射性核素的治疗Ac，显示出成功的肿瘤控制能力，但也具有口干症和骨髓抑制等副作用。靶向PSMA的治疗剂和显像剂已超越了放射性核素，包括纳米颗粒和抗体药物结合物。
　　 PSMA靶向成像和治疗剂的靶与背景之比高，再加上BNCT的高功效，表明硼标记的PSMA靶向剂可作为有效的BNCT剂。原则上，该方法可以将PSMA定向治疗的高靶标与背景比的好处与中子束提供的空间定位相结合。因此，该方法可用于治疗低转移性前列腺癌，从而潜在地最大程度地降低放射性核素的目标副作用，包括口干症和骨髓抑制。已经报道了硼标记的PSMA靶向剂，表征了其与酶的结合，并使用放射性碘标记的衍生物研究了其初始生物分布。但是，这些研究并未确定肿瘤中硼的吸收程度，这对于预测治疗效果必不可少。我们假设，通过使用含硼的靶标特异性分子，与正常组织相比，PSMA在PCa细胞上的局部表达和增强表达可以使BNCT能够将硼充分且优先地递送至PCa。我们设计了一系列针对PSMA的硼标记试剂，包括三种成分-基于尿素的PSMA结合基团，连接基团和含有1、10或20个硼原子的取代基。在这项研究中，我们报告了一系列针对PSMA的硼标记试剂的合成及其在生物分布测定中的初步体外和体内评估。
　　 含硼化合物1a–h的IC50值是通过在针对Ga-PSMA-11的竞争性放射性配体结合试验中筛选而确定的。如先前报道的那样，使用Ge/Ga发生器和手动合成模型合成Ga-PSMA-11，使用5μg前体，每批产量约10-35mCi。2-戊二酸是已知的PSMA抑制剂，已被选作阳性对照。将22Rv1细胞接种于48孔板中，然后在补充10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行测试之前48小时。当进行测定时，细胞数为每孔约250,000。除去生长培养基，并用PBS洗涤3次。将无血清RPMI1640中各种浓度的测试化合物与10μCi的Ga-PSMA-11一起添加到细胞中。将细胞在该缓冲液中于37°C孵育1小时。然后，通过移液管去除放射性介质，将细胞用PBS洗涤两次，然后添加250μL5NNaOH裂解细胞。将裂解物转移到小瓶中，并使用Hidex伽玛计数器对结合的放射性进行计数。IC50使用GraphPadPrism软件通过非线性回归确定值。
　　 使用CellTiter-Glo试剂盒进行细胞毒性测定，以测量与各种浓度的化合物孵育后的细胞活力。将22Rv1细胞接种于96孔板中，然后在补充10％胎牛血清的RPMI1640培养基中测试之前48h。除去生长培养基，并用PBS洗涤3次。将各种浓度的被测化合物溶于PBS和空白溶液中，并加入细胞中。将细胞在该缓冲液中于37°C孵育4小时。然后，将100μLCellTiter-Glo缓冲液添加到每个孔中。将混合物在室温下孵育15分钟，并使用发光计测量发光。
　　 对于动物毒性实验，对非肿瘤雄性无胸腺小鼠给予腹膜内剂量的选定硼化化合物分级，以确定最大耐受剂量，并监测24小时。每个测试组包含两只小鼠。如果动物表现出我们的IACUC指南概述的身体症状，则将动物安乐死。
　　 收集的器官也经过ICP-OES分析，以测定总硼含量。如所预期的，当不施用硼化合物时，媒介物组导致组织中硼的吸收最小。已知的BNCT化合物BPA在血液，肾脏，胰腺，尤其是肝脏中积累。对于1a，与1小时相比，血液中的硼含量从1小时的7.8微克/克的组织显着降低到1.7微克/克的组织，表明该化合物的快速清除。肾脏吸收量大于肝脏吸收量，这表明主要是肾脏消除，这是基于其亲水性所预期的。肿瘤对硼的摄取为4.1μg每克组织，这与肌肉中对硼的摄取相似。对于复合第1天，血液中的硼含量在4h时略有下降，从22.5降低至17.1μg每克组织，而在1h时，表明体内的循环时间更长。在肝脏中比在肾脏中摄取更多，表明主要是肝胆清除。1小时内肿瘤中的硼摄入量为4.4μg每克组织，类似于肌肉中的硼摄入量。但是，在4小时时肿瘤中的硼摄入量为4.2μg每克组织，比肌肉中的硼摄入量高2倍。对于化合物1f，从17.4到78.3μg每克组织的1小时相比，血硼含量在4h时显着增加，这表明该化合物在小鼠体内吸收缓慢，循环时间长。肝脏比肾脏吸收更多，再次提示肝胆清除率。肿瘤的硼摄取量在1h时为3.3μg每克组织，在4h时为3.4μg每克组织，低于肌肉中的硼摄取量。总体而言，疏水性更高的化合物1d和1f在血液中的循环时间更长。在BPA与化合物1d和1f之间观察到相似的总肿瘤吸收，范围为3.3至7.1μg每克，而化合物1a在4h时显示出降低的肿瘤吸收。
　　 在本报告中，我们证明了基于常见尿素骨架的一系列含硼PSMA抑制剂的合成，初步体外和体内评估。尽管所有这八种boro-PSMA化合物均具有相同的基于尿素的PSMA结合骨架，但侧链的改变显着影响了它们的结合亲和力，细胞内化能力和药代动力学。总的来说，与已知的高亲和力PSMA抑制剂PMPA相比，所有化合物在竞争性放射性配体结合试验的基础上均表现出相同或更高的结合PSMA的能力。考虑到基于尿素的PSMA结合支架的多功能性，这些化合物的非常高的结合亲和力不足为奇。
　　 基于这些令人鼓舞的初步结果，使用成像和硼生物分布测定法将三种化合物推进了体内初步测试。选择化合物1a作为亲水性的含单硼的试剂。选择化合物1d作为碳硼烷基团的代表，其最高IC50为20.3nM。选择化合物1f，因为它具有两个碳硼烷取代基和最大数量的硼原子以及合理的结合亲和力。PET成像和Ga-PSMA-11生物分布分析表明，这三种化合物均在体内表现出较高的PSMA结合力，而BPA没有证明体内PSMA结合。然而，硼-PSMA化合物表现出不同的药代动力学和整体肿瘤硼吸收。亲水化合物1a表现出快速的肾脏清除率和PSMA在体内的有效结合，这可以通过阻止肿瘤中Ga-PSMA-11的吸收来判断。然而，尽管给药剂量最高，但总的肿瘤硼吸收量是4h测试的所有化合物中最低的，可能是由于每个分子中只有一个硼原子。总之，由于化合物1a的三个羧酸和硼酸基团，它是一个非常亲水的分子。相反，疏水性更强的碳硼烷化合物1d和1f表现出主要的肝胆清除率，同时仍显示出体内有效的Ga-PSMA-11阻断作用。在体内这些化合物的半衰期似乎比显著更大1A，如通过在血液中的高的剩余硼含量在给药后4小时判断。与BNC最常用的药物BPA相比，化合物1d和1f在肿瘤中的硼吸收总量相似。但是，出乎意料的结果是，与1d相比，每个分子中硼含量的增加并未增加1f在肿瘤中的摄取，这可能是由于吸收缓慢所致。对于化合物1d和1F，在血液中的硼浓度为仍然4小时后高，表示4小时，而且毒性的高风险后，在肿瘤增加的硼摄取。
　　 在这项研究中，我们通过与Ga-PSMA-11PET的竞争结合测定法测定了受体的参与，并通过生物分布测定法和总组织硼含量的ICP-MS直接测定了肿瘤的摄取。确定含硼化合物生物分布的另一种替代方法可以考虑用于未来的研究，即使用可以与金属成像探针配合使用的螯合剂直接标记硼-PSMA衍生物，例如用于PET的Ga或用于MRI的Gd。
　　 迄今为止，已有两项关于硼-PSMA抑制剂的报道。Byun的小组报告了含碳硼烷的PSMA抑制剂的合成和PSMA抑制剂的X射线结构表征。但是，没有在动物模型中进一步评估这些化合物。Valliant的小组还生产了一系列含碳硼烷的PSMA抑制剂，但与PMPA相比，IC50并未得到改善。相反，我们的研究中的boro-PSMA抑制剂与PMPA相比，IC50降低了多达26倍。我们还进一步揭示了它们的结构-活性关系，证明了它们在体内结合PSMA，并确定了它们在22Rv1异种移植小鼠模型中的硼生物分布和肿瘤吸收。总而言之，这些实验表明，与最常用的BNCT试剂BPA相比，硼-PSMA化合物1d和1f的总体摄入量相似。与先前报道的评估BPA在肿瘤中摄取的研究相比，我们的BPA结果表明在4h时间点的肿瘤/肌肉摄取率为2.0，与其他先前报道的1.5至4.4一致。在我们的研究中，肿瘤4小时的BPA摄取为7.1±4.0μg每克。总体而言，双酚A的生物分布结果与以前在相似条件下进行的报告相似。
　　 通常认为，至少20–50μg每克的硼吸收对有效的肿瘤治疗是必要的。肿瘤与正常组织中的硼比率需要大于3：1才能达到选择性。然而，硼的吸收不能达到要求，表明目前的化合物和给药方案不足以用于治疗。为了向肿瘤递送足够的硼，既需要高亲和力结合又需要高丰度靶。在这项研究中，使用了大量的硼化合物，体内饱和的PSMA结合位点已通过Ga-PSMA-11结合和封闭分析。几种方法可用于改善硼向肿瘤的递送。首先，化合物的给药时间和途径可以改变。在测试的最新时间点，化合物1d和1f的血液含量非常高，并且与1小时相比，在4小时时肿瘤与肌肉的比率增加，表明更长的温育时间可以改善整体硼的输送以及肿瘤与血液和肿瘤与肌肉的比例。第二种可能的改进途径是每个PSMA抑制剂包含更多的硼原子。尽管化合物1f包含20个原子，但已报道了更大的取代基，例如树状聚合物和纳米颗粒。原则上，这些取代基可以被附加到基于尿素的PSMA试剂上以实现更高的硼递送。最后，使用具有增加的PSMA表达的动物模型可能会改善肿瘤硼的吸收。尽管选择22Rv1模型是因为其具有方便，快速和可预测的肿瘤生长，但与其他细胞系相比，其总体PSMA表达水平较低。方法的这些改进代表了未来研究的重要领域。优化药代动力学和给药方案后，可以在带有适当肿瘤异种移植物的小鼠中进行初始治疗研究。
　　 在这项研究中，成功合成了一系列含硼酸和碳硼烷的PSMA抑制剂。在体外结合数据显示高结合亲和力的PSMA所有含硼抑制剂。尤其是，化合物1d的IC50值比众所周知的PSMA抑制剂PMPA低26倍。PET成像数据显示含硼PSMA化合物可阻止Ga-PSMA-11吸收，从而证明了体内PSMA抑制剂与其靶标的结合。硼吸收和分布测定表明，与标准化合物BPA的比例相比，硼的吸收约为4μg硼每克，肿瘤/肌肉的比例相似。尽管摄取量低于所需的20μg硼每克肿瘤阈值，但这些数据表明，通过进一步优化，用boro-PSMA治疗低转移性前列腺癌是可行的。