穿透细胞的肽缀合用于硼中子捕获疗法

　　研究中，研究人员设计并合成了靶向细胞器的穿透细胞肽的硼化合物，以增加其细胞摄取并控制细胞内位置，以诱导硼中子捕获疗法中复杂的抗癌生物活性，在体外BNCT分析中用中子辐照可导致ATP减少和凋亡的抗癌作用。
　　 在硼中子俘获疗法中，癌细胞对硼10原子的内在化通过生成α粒子和反冲锂7来诱导细胞死亡。被中子辐照的原子核具有高线性能量传递和短距离射程。低能热中子可以被B原子吸收，从而导致产生高线性能量转移α粒子和Li原子核。粒子在短距离内产生高能量，这仅限于单个电池的直径。通过当前的BNCT技术已经获得了对难治性癌症如脑瘤和头颈癌的有效治疗益处的蓄积和细胞摄取功效不足。
　　 对于一个成功的方法BNCT，足够量的乙应在肿瘤中累积，其细胞毒性诱导热中子照射的疗效，需要进一步改进。BNCT的功效依赖于相对高的量的递送至靶细胞;据估计，每克肿瘤必须递送约30μg的硼10，以维持致命的肿瘤细胞损伤。因此，基于第三代递送系统已被开发中的定位的方法，包括肿瘤特异性受体的抗体和用于主动靶向和使用高分子量的递送剂，例如碳纳米管，脂质体，胶束的配体的缀合，树枝状大分子和其他人造纳米粒子，形成主动和被动靶向的受体配体。因此，已经广泛开发了第三代递送系统，尤其是针对靶向细胞质膜的癌症受体。但是，细胞内靶向，例如靶向细胞器，很少用于BNCT研究。当细胞死亡是造成由BNCT的细胞器损伤诱导的，所述的细胞死亡的效力和途径是由受损细胞器。在这里，研究人员旨在利用细胞穿透肽开发BNCT技术15增强了硼化合物的细胞摄取及其在细胞内的受控定位。研究人员评估了硼化合物在其受控的细胞内位置对BNCT后生物学活性的影响。
　　 在研究中，研究人员设计并合成了靶向细胞器的肽共轭硼簇，以增加其细胞摄取并控制其细胞内位置，从而在BNCT下诱导复杂的癌细胞杀伤活性。研究人员采用了三种类型的CPP，以增强细胞对硼化合物的摄取，细胞膜渗透和受控的细胞内定位。八-精氨酸是典型的富含精氨酸的CPP。CPP被各种类型的单元通过内吞途径，特别是通过巨胞吞作用，以及通过内体逃逸或直接质膜穿透而使肽类细胞质释放。在研究中，研究人员使用R8的D对映体防止肽水解酶消化肽。对于线粒体靶向，研究人员以前开发质膜渗透的，线粒体靶向肽。该肽衍生自人工两亲性α-螺旋肽KLA，该肽被设计为抗菌肽。使用KLA的D-对映体。因为在肽序列中的精氨酸残基在细胞膜通透性发挥关键作用所述的CPP，的取代的D赖氨酸在KLA用肽D-精氨酸产生具有高线粒体靶向能力和高质膜渗透性的新型载体肽。由于细菌和线粒体膜之间的相似性，已将抗菌肽用作凋亡诱导剂。23线粒体内部具有负电压，并且抗菌肽可能以电压依赖性方式与线粒体膜相互作用。如“材料和方法”部分中所述，所有肽的化学合成都是通过Fmoc固相肽合成进行的。羧基十二硼酸盐衍生物到的CPP的N端进行来完成缀合。
　　 首先，研究人员使用共聚焦激光显微镜检查了CPP共轭对十二硼酸盐的细胞摄取，胞质释放和细胞内定位的影响。在含有D-MEM的D-MEM中，将C6胶质瘤细胞在37°C下用与RLA肽或r8肽偶联的荧光标记的十二脱硼酸酯处理30分钟。共聚焦激光显微镜观察前10％的胎牛血清。在DB-RLA的情况下，样品被细胞摄取后，观察到荧光带状线粒体结构，并且未确认到内体样点信号。另一方面，在DB-r8的情况下，可以观察到内体样点和胞质核荧光信号。使用抗十二碳酸酯抗体，研究人员还检查了无荧光标记的CPP缀合的十二碳酸酯的细胞摄取。在固定细胞之前，将C6胶质瘤细胞在10％含FBS的D-MEM中在37°C下用CPP缀合的十二硼酸盐处理30分钟，然后进行细胞固定，抗十二硼酸盐抗体的细胞染色和共聚焦激光显微镜观察。即使在使用抗体的实验中，也可以观察到DB-RLA的线粒体积累和DB-r8的胞质释放。DB-RLA的荧光信号与MitoTracker线粒体染色共定位。在DB-r8的情况下，即使在胞浆中存在荧光信号，也观察到与MitoTracker染色缺乏共定位的现象。显示了通过酶联免疫吸附测定分析的C6神经胶质瘤细胞对内在硼的定量分析。在相似的细胞摄取条件下，与没有CPP缀合的BSH相比，RLA肽共降解的结合使细胞摄取增加了约4倍。缀合为十二酸酯的RLA肽也增加了细胞摄取功效。然而，与r8肽的缀合降低了细胞的十二硼酸盐摄取。基本上，寡精氨酸肽的细胞摄取功效显示出S型增加，这取决于肽的浓度。带负电荷的硼化合物与r8肽的结合可能会影响乙状细胞摄取的增加，导致硼化合物的细胞摄取效率低下，尽管应进一步研究详细的原因。对于BSH，细胞摄取BSH后，可通过共聚焦激光显微镜观察到内体样荧光点信号和与质膜的结合，表明每个CPP的共轭共分解都可以极大地控制硼化合物在细胞吸收后的细胞内位置。C6胶质瘤细胞的存活率没有受到影响，如在用每种CPP缀合的十二硼酸盐处理后通过WST-1分析进行分析。
　　 通过与线粒体或胞浆靶向的CPP偶联，控制了硼化合物的胞内位置。在37°C下，用含10％FBS的D-MEM中的每种BODIPY标记的十二硼酸盐-CPP偶联物处理的C6胶质瘤细胞共聚焦显微镜观察30分钟。绿色信号：BODIPY，蓝色信号：Hoechst33342。比例尺：9μm和20μm。在37°C下用含10％FBS的D-MEM中的每个样品处理30分钟后，通过ELISA测定评估C6胶质瘤细胞中硼细胞摄取的量。用WST-1分析评估，在37°C下，将含10％FBS的D-MEM中的每个样品处理的C6胶质瘤细胞在30°C下的细胞活力。数据表示为三个实验的平均值。
　　 研究人员还检查了DB-RLA肽在细胞摄取后对线粒体的保留。将C6胶质瘤细胞在37°C下用DB-RLA处理30分钟后，洗涤细胞以去除未被细胞吸收的肽，然后用新鲜的细胞培养基处理细胞在37°C下放置24小时。使用共聚焦激光显微镜观察表明，即使将细胞在无肽培养基中孵育24小时后，线粒体也能强烈保留DB-RLA显示了主要观察到的荧光带状线粒体结构。相反，在DB-r8的情况下，在肽处理后可以观察到肽的胞质释放；然而，在细胞洗涤并在新鲜细胞培养基中于37°C孵育24小时后，仅观察到非常弱的内体样荧光点信号。这些结果表明，RLA肽具有很强的能力，可以在细胞膜穿透和线粒体积累后保留其在线粒体中的定位。
　　 接下来，研究人员检查了每种CPP-十二硼酸酯结合物对热中子辐照的影响及其通过BNCT杀灭细胞的活性。将C6胶质瘤细胞在10％含FBS的D-MEM中在37°C下用CPP结合的十二硼酸酯处理30分钟后，在室温下用热中子照射细胞90分钟。如材料和方法部分中所述，通过集落分析评估细胞活力7天。在BSH的情况下，高浓度的BSH显示出较弱的细胞杀伤活性。较低浓度的DB-r8表现出与BSH相似的杀细胞活性。DB-RLA处理与其他CPP缀合的十溴酸盐相比具有最高的细胞杀伤活性。这些发现表明，将CPPs结合到十分解代谢物上可增强其细胞膜渗透性和胞质定位，特别是在将RLA肽用于线粒体积累时，可通过热中子辐照有效地提高十二分解代谢物的细胞杀伤活性。
　　 为了了解为什么DB-RLA的治疗在热中子辐照后显示出最佳的细胞杀伤活性，研究人员评估了细胞死亡途径。图S6a显示了在37°C下在含10％FBS的D-MEM中对每种十二水合物处理30分钟后，C6胶质瘤细胞中的胱天蛋白酶3/7活性。胱天蛋白酶3和7是细胞凋亡的指示剂，并且用BSH和热中子辐射处理并未增加胱天蛋白酶3的活性。另一方面，BSH，DB-r8和DB-RLA的每种处理均类似地增加了caspase3/7活性，尽管DB-与热中子辐照后的其他样品相比，RLA具有最高的细胞杀伤活性。研究人员还检测了早期细胞凋亡中质膜上磷脂酰丝氨酸的含量。显示了使用FITC标记的膜联蛋白V检测C6胶质瘤细胞膜上的PS，以及对BSH，DB-r8和DB-RLA的处理同样在热中子辐照后增加了质膜上结合的FITC标记的膜联蛋白V的荧光强度。研究人员还评估了C6胶质瘤细胞中5'-三磷酸腺苷的含量，因为线粒体在细胞能量代谢中起着基本作用，并且是ATP的主要产生者，这对于维持细胞体内稳态非常重要。图S6b显示了在37°C，含10％FBS的D-MEM和中子辐照条件下，用每种十二水合物处理30分钟后，C6胶质瘤细胞的相对ATP含量。DB-r8显着降低了细胞ATP含量，用DB-RLA处理后，ATP含量进一步降低。这些结果表明，RLA肽可以通过细胞膜从细胞外部将十二硼酸转移至线粒体，导致热中子辐照后ATP含量降低和有效的细胞杀伤活性。ATP含量降低可能是细胞杀伤活性的关键因素之一。但是，需要进一步的实验来阐明详细的机制。据报道，硼化合物处理和热中子辐照引起的细胞凋亡具有增加的细胞凋亡标记。蛋白质组学分析表明，内质网中的蛋白质功能，DNA修复和RNA加工通过热中子辐照导致显着变化。硼化合物处理和热中子辐照诱导坏死的报道也有报道，但是BNCT中坏死诱导的详细机制仍然未知。在研究中，DB-RLA的治疗显示ATP含量比DB-r8进一步降低，并且在DB-RLA和DB-r8的治疗中caspase3/7活性水平相似。ATP耗竭诱导坏死，表明坏死不需要细胞内ATP。由于已经报道了阻止线粒体ATP产生的线粒体膜电位的丧失是凋亡的早期步骤，因此必须通过糖酵解来提供其余细胞凋亡过程所需的细胞内ATP。BNCT中的DB-RLA可能会增强坏死，应研究详细的机制。
　　 在研究中，研究人员使用CPP实现了十二烷基酸酯的局部细胞内递送，并发现由于特定的细胞杀伤途径，这种在细胞内的受控递送对于有效诱导BNCT的细胞杀伤活性非常重要。研究人员的发现不仅将有助于BNCT的发展，而且还将有助于其他治疗技术的发展。研究人员强调了以细胞器为目标的系统对实现治疗分子的复杂生物学活性的重要性。